Introducción a las técnicas cromatográficas

Definición de cromatografía

Según la IUPAC, la cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar son distribuidos entre dos fases, una de las cuales permanece estacionaria mientras que la otra se mueve en una dirección determinada.

Por lo tanto, en cualquier proceso cromatográfico distinguimos:

  • Una fase móvil (FM), que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico, en la que va disuelta la muestra.
  • Una fase estacionaria (FE) inmiscible, la cual se mantiene fija sobre una columna o sobre una superficie sólida.

Los componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven con mayor lentitud en la fase móvil, mientras que aquellos que se unen débilmente a la fase estacionaria se mueven con mayor rapidez. Esta diferencia de velocidades en el seno de la fase móvil permite la separación y el análisis cualitativo o cuantitativo de los componentes.

Clasificación de los métodos cromatográficos

Según la forma de contacto entre la FM y la FE:

  • Cromatografía en columna: la FE se introduce en una columna estrecha a través de la cual pasa la FM por efecto de la gravedad o de una presión aplicada.

cromatografia-columna

  • Cromatografía plana: la FE se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel y la FM se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad.

cromatografia-plana

Según el estado físico de la FM:

  • Cromatografía de líquidos: la fase móvil es un líquido. Distinguimos la cromatografía líquido-líquido o de reparto (la FE es un líquido), la cromatografía líquido-sólido o de adsorción (la FE es un sólido), la cromatografía de intercambio iónico (la FE es una resina intercambiadora de iones), la cromatografía de exclusión por tamaño (la FE es un líquido en los intersticios de un sólido polimérico) o la cromatografía de afinidad (la FE es un grupo de líquidos específicos unidos a una superficie sólida).
  • Cromatografía de gases: la fase móvil es un gas. Distinguimos la cromatografía de gas-líquido (la FE es un líquido adsorbido o unido a una superficie sólida) o la cromatografía gas-sólido (la FE es un sólido).
  • Cromatografía de fluidos supercríticos: la fase móvil es un fluido supercrítico (la FE está compuesta por moléculas orgánicas enlazadas a una superficie sólida).

Cromatografía de elución en Columna

La elución implica el transporte de una especie a través de una columna por la adición de nueva fase móvil:

eluato

Inicialmente se introduce una cierta cantidad de muestra diluida en FM. Al ir añadiendo FM nueva, el eluyente (la parte de la muestra contenida en en la FM) desciende por la columna, donde tiene lugar un reparto o distribución entre la FM y la FE, en una serie continua de transferencias entre las dos fases. Según sea el coeficiente de reparto, los solutos estarán más o menos tiempo en la fase móvil, que es la que consigue hacerlos avanzar. Por tanto, cuanto más tiempo pasen en la fase móvil, más rápidamente se moverán. Los solutos que presenten una mayor afinidad por la FE quedarán más tiempo retenidos, por lo que avanzarán a menor velocidad.

La diferencia en la velocidad de desplazamiento de los solutos o analitos permite su separación en zonas o bandas a lo largo de la columna. A medida que se va añadiendo más FM a la columna, las bandas van llegando individualmente al final de la columna y son eluidas. La fracción eluida se denomina eluato.

Si al final de la columna se coloca un detector que responde a la concentración del soluto y se registra su señal en función del tiempo (o del volumen de FM añadido) se obtiene un cromatograma. Lógicamente, el proceso de separación produce una dilución considerable del analito, por lo que los detectores empleados deben ser más sensibles que los que serían necesarios si el proceso de separación no fuera imprescindible.

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