Instrumentación en HPLC

Los equipos de cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) trabajan a grandes presiones, por lo que son complejos y caros. Sus componentes fundamentales se aprecian en el siguiente esquema:

Esquema-HPLC

  • Sistema de suministro y almacenamiento de fase móvil
  • Sistema de bombeo
  • Sistema de inyección de muestra
  • Columna cromatográfica
  • Detector

Sistema de suministro y almacenamiento de fase móvil

Garantiza la disponibilidad de fase móvil al sistema en condiciones apropiadas, de modo que se evite la contaminación y la degradación de la misma.

La fase móvil en HPLC está formada por un disolvente o por una mezcla de ellos, cada uno de los cuales está contenido en un recipiente, generalmente de vidrio, aunque en ocasiones se emplean otros materiales, como el politetrafluoroetileno. Los recipientes deben disponer de tapones que impidan la contaminación por gases o partículas en suspensión presentes en el aire del laboratorio.

Para evitar flujos inestables, la formación de burbujas o la interferencia de partículas extrañas los disolventes deben estar filtrados y desgasificados. Esto puede realizarse mediante un tratamiento previo que elimine los gases y la materia en suspensión (filtros milipore) o bien integrando sistemas de filtrado y desgasificación en el equipo de HPLC.

sistema-suministro-Fase-movil-HPLC

La elución se puede realizar de dos maneras:

  • Elución isocrática: cuando se emplea un único disolvente o una mezcla de disolventes de composición constante.
  • Elución en gradiente: cuando se emplea una mezcla de disolventes cuya concentración se hace variar a largo del proceso, con el fin de modificar la polaridad de la fase móvil y disminuir el tiempo de separación (es un efecto semejante al que se produce cuando modificamos la temperatura en cromatografía de gases).

Los instrumentos modernos están equipados con válvulas de alimentación que permiten controlar de manera programada la velocidad de flujo de cada disolvente en cada instante.

Sistema de bombeo

Todos los sistemas HPLC incorporan un sistema de bombeo, con las siguientes características:

  • Debe ser capaz de gestionar altas presiones, de hasta 400 atm.
  • Mantener un flujo libre de pulsos
  • Proporcionar caudales constantes y reproducibles
  • Permitir cambios de disolvente de modo simple y rápido
  • Ser químicamente inerte y resistente a la corrosión

Las más empleadas son las bombas recíprocas, que consisten en una pequeña cámara en la que el disolvente es impulsado por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor. Las entrada y salida del disolvente se regula mediante dos válvulas antiretorno que se abren y cierran alternativamente, permitendo el paso de fluido en un solo sentido.

bomba-reciproca

Entre las ventajas que presentan se encuentran: pequeño volumen interno, altas presiones de salida, caudales constantes y compatibilidad con la elución en gradiente. Sin embargo, generan un flujo pulsado, que se ha de amortiguar para evitar la generación de ruido.

Sistemas de inyección de muestra

La inyección de un volumen de muestra preciso, y muy pequeño (5-500 μL), debe hacerse a la entrada de la columna en un breve periodo de tiempo para perturbar lo menos posible el régimen de circulación de la fase móvil y evitar el ensanchamiento de banda. La reproducibilidad de la inyección va a condicionar la precisión de las medidas.

El sistema de inyección está formado por válvulas rotatorias de alta presión de varias vías manuales o automatizadas. Constan de un doble circuito, uno de los cuales está conectado al exterior y el otro al propio sistema, pudiendo intercambiarse de forma rápida y simple entre las dos posiciones:

Valvula-seis-vias

Válvula de seis vías para un sistema de inyección en HPLC

Con la válvula en la posición de llenado de la izquierda la fase móvil pasa de la bomba a la columna mientras que la muestra se inyecta en el otro circuito con forma de bucle. Cuando la válvula gira hacia la posición de inyección de la derecha, la fase móvil arrastra la muestra hacia la columna. El objetivo de utilizar este tipo de válvulas es de no interrumpir el flujo de fase móvil a través de la columna e introducir en el flujo de la misma un volumen de muestra que estará contenida en un tramo de tubería de volumen fijo.

Columnas Analíticas en HPLC

Son columnas rectas, fabricadas habitualmente de acero, aunque también se emplean columnas construidas de vidrio y materiales poliméricos. La mayoría de ellas tienen una longitud entre 5 y 30 cm, y su diámetro interno varía entre 3 y 10 mm. Los rellenos más comunes son de 5 a 10 μm y se mantienen en el interior del tubo mediante cierres porosos de metal o de vidrio. Actualmente existen columnas de mayor eficacia y dimensiones más reducidas, que superan los 100.000 platos/metro con un consumo mínimo de disolvente (lo cual abarata considerablemente el proceso).

Precolumnas

Las columnas son delicadas y caras, por lo que se emplean precolumnas, de composición similar a la de la columna (aunque con un diámetro de partícula de mayor tamaño para minimizar la caída de presión). Las precolumnas eliminan los contaminantes, la materia en suspensión y aquellos componentes que se unen de manera irreversible a la fase estacionaria, de manera que cuando está muy contaminada, se vacía y se rellena de nuevo o se reemplaza por otra nueva.

Columnas termostatizadas

En algunas ocasiones se obtienen mejores resultados calentando la columna, ya que la viscosidad del disolvente disminuye (se consigue un mayor caudal o se reduce la presión requerida) y se acortan los tiempos de retención. Sin embargo, un aumento de la temperatura también puede degradar la fase estacionaria y reducir el tiempo de vida de la columna, por lo que se deben emplear hornos que controlen la temperatura de una manera muy precisa (de décimas de grado).

Relleno de la columna

El relleno empleado en las columnas de HPLC debe ser químicamente inerte, mecánicamente resistente y poseer un tamaño de partícula bien definido. Habitualmente está formado por partículas esféricas microporosas de sílice muy puro, que son permeables al disolvente y presentan una elevada área superficial (no puede emplearse con fases móviles cuyo pH sea mayor que 8). También se emplean rellenos de alúmina (u otros óxidos metálicos), grafito poroso o materiales poliméricos (como estireno-divinilbenceno).

El relleno puede actuar como mero soporte de una fase estacionaria líquida o, convenientemente tratado, puede intervenir directamente en el proceso de separación.

Detectores en HPLC

A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de líquidos no hay detectores universales tan fiables como lo son el detector FID o el TCD. Sus características (sensibilidad, estabilidad, reproducibilidad, respuesta lineal, tiempo de respuesta corto, fácil manejo) son similares a éstos, aunque no es necesario que sean sensibles en un intervalo de temperaturas tan elevado y deben tener un volumen interno mínimo para reducir el ensanchamiento de banda extracolumna.

Una descripción de los principales detectores la puedes encontrar aquí.

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