Extracción con fluidos supercríticos

Los fluidos supercríticos se forman cuando una sustancia se encuentra en condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico:

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Los fluidos supercríticos presentan propiedades intermedias entre un gas y un líquido: densidad elevada (próxima a la del líquido), baja viscosidad (cercana a la del gas) y un coeficiente de difusión superior al del líquido. Estas características favorecen su penetración en diferentes matrices y la solubilización de los solutos.

La extracción con fluidos supercríticos (SFE) se fundamenta en las propiedades que presentan los disolventes cuando se encuentran en ese estado. En los años 60 y 70 se desarrolló el estudio de esta técnica y en 1979 se contruyó la primera planta de producción a gran escala basada en SFE para la extracción de cafeína de los granos de café sin tostar. A partir de los años 80 se empezó a estudiar esta técnica desde el punto de vista analítico, como una alternativa a los métodos tradicionales de preparación de muestra.

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Al igual que en la cromatografía de fluidos supercríticos, el disolvente más empleado es el dióxido de carbono: tiene una presión crítica moderada (73 atm) y una baja temperatura crítica (31’3 ºC), por lo que es ideal para la extracción de muchos compuestos termolábiles; es fácilmente separable del soluto y no causa problemas ambientales; no es inflamable, ni tóxico y es económico (su limitación está en la separación de compuestos polares).

Instrumentación en SFE

Un equipo de extracción con fluidos supercríticos consta de las siguientes partes:

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El sistema de suministro de dióxido de carbono es muy importante, pues se requiere una elevada pureza. Las bombas empleadas en extracción con fluidos supercríticos deben ser capaces de impulsar el dióxido de carbono a las altas presiones requeridas, manteniendo un flujo constante. Se requiere un horno calentador capaz de controlar la temperatura del proceso, así como unas celdas o cámaras de extracción capaces de soportar las presiones generadas por la bomba.

La parte más importante del diseño del extractor es el restrictor, que controla el flujo del fluido supercrítico que circula a través de la celda y que, ademas, se encarga de despresurizar el fluido haciéndolo pasar de las condiciones supercríticas existentes en la celda de extracción a condiciones atmosféricas. Existen dos tipos:

  • Restrictores fijos: consisten en un tubo capilar de sílice o metal. El flujo y la presión del fluido se regulan en función de su diámetro interno y de su longitud. Deben ser reemplazados cada vez que se desee variar la presión del sistema.
  • Restrictores variables: son más complejos que los anteriores, y regulan la presión mecánicamente, independientemente del flujo, mediante el tamaño variable de una pequeña abertura, por lo que no tienen que ser reemplazados durante la extracción.

Finalmente, el sistema de recogida del soluto se encarga de aumentar la densidad del fluido y, en consecuencia, disminuir su poder disolvente, logrando la separación del soluto y el fluido (generalmente, se consigue por despresurización del fluido). Para utilizar esta técnica con fines analíticos:

  • El analito puede recogerse sobre una superficie sólida, en un adsorbente sólido o en un disolvente orgánico (sistemas fuera de línea). La ventaja de este método es que permite aplicar varias técnicas posteriormente.
  • El sistema SFE puede acoplarse a un método cromatográfico (un cromatógrafo de gases, por ejemplo), de modo que el propio paso de extracción hace las veces de inyector de la muestra en la columna cromatográfica (sistemas SFE en línea). En este caso, toda la muestra pasa al cromatógrafo y no se podrían realizar otros análisis, aunque resulta un método mucho más exacto y sensible.

Aplicaciones de la SFE

  • Extracción de aditivos en polímeros, presentes en muy bajas concentraciones, que permite su posterior análisis por métodos cromatográficos.
  • Extracción de contaminantes ambientales, presentes en suelos, sedimentos, tejidos vegetales o animales, partículas atmosféricas… (especialmente pesticidas y herbicidas)
  • Extracción de lípidos, vitaminas, compuestos aromáticos, cafeína… en alimentos
  • Extracción de compuestos farmacéuticos

Instrumentación en la cromatografía de fluidos supercríticos

La instrumentación empleada en la cromatografía de fluidos supercríticos es similar a la de cromatografía de líquidos, aunque debe incorporar un horno termostato (similar al de cromatografía de gases, para controlar con precisión la temperatura de la fase móvil) y un restrictor o un sistema de contrapresión (que sirve para mantener la presión de la columna en el nivel deseado y para convertir el eluato a gas y arrastrarlo al detector):

schema-preparative-SFC

Un restrictor típico consiste en un capilar de 2 a 10 cm de longitud y de 5 a 10 μm de diámetro unido al extremo final de la columna. Son intercambiables, para ajustarse a distintas presiones y tasas de flujo.

Columnas cromatográficas en SFC

Debido a la baja viscosidad de los fluidos supercríticos, las columnas deben ser mucho más largas que las empleadas en cromatografía de líquidos. En cromatografía de fluidos supercríticos se emplean tanto las columnas capilares como las columnas de relleno:

  • Columnas capilares o tubulares abiertas: son de sílice fundida con recubrimientos internos (de un espesor de 0’05 a 1 μm) de varios tipos de siloxanos enlazados o entrecruzados, similares a las empleadas en cromatografía de gases, con longitudes que van desde los 10 a los 20 m y diámetros internos que oscilan entre 50 y 100 μm.
  • Columnas de relleno: son de acero inoxidable de 10 a 25 cm de largo, diámetros que varían entre 0’5 y 5 mm y cuyas partículas tienen un diámetro que oscila entre 3 y 10 μm. Son semejantes a las empleadas en cromatografía de reparto y proporcionan más platos teóricos (más de 100.000) y manejan volúmenes más grandes de muestra que las columnas capilares.

Fases móviles EN SFC

Las propiedades de algunos de los fluidos supercríticos empleados en SFC se recogen en la siguiente tabla:

fluidos-supercriticos-propiedades

La fase móvil más ampliamente utilizada en cromatografía de fluidos supercríticos es el dióxido de carbono:

  • Su temperatura crítica es de 31’3 ºC y su presión crítica es de 72’9 atm, por lo que puede ser utilizado en un amplio rango de temperaturas y presiones, que no superan los límites de operación de los actuales equipos de HPLC.
  • Es un disolvente excelente para una gran cantidad de moléculas orgánicas no polares.
  • Es inodoro y no es tóxico.
  • Es más económico y fácilmente disponible.
  • Es una sustancia transparente en el ultravioleta.

En algunas ocasiones se introducen modificadores orgánicos (como el metanol) en pequeñas concentraciones (1 %) para modificar los factores de selectividad (α) de los analitos.

Detectores en SFC

La principal ventaja de la cromatografía con fluidos supercríticos frente a la HPLC es que se pueden utilizar detectores de ionización de llama, como en la cromatografía de gases.

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Este detector es de respuesta universal para compuestos orgánicos, de elevada sensibilidad y exento de problemas.

También pueden emplearse, como en la cromatografía de gases, detectores de absorción en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisión de fluorescencia, termoiónico y fotométrico de llama.

Los espectrómetros de masas también se pueden adaptar como detectores, más fácilmente que para HPLC.

Cromatografía de fluidos supercríticos

La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) emplea fluidos supercríticos como fase móvil. Un fluido supercrítico se forma cuando una sustancia se encuentra por encima de su presión y temperatura críticas (punto crítico):

fluido-supercritico

  • Temperatura crítica: es aquella a partir de la cual una sustancia no puede existir en fase líquida, independientemente de la presión.
  • Presión crítica: máxima presión a la cual un líquido puede ser convertido en un gas por incremento de la temperatura.

Al calentar una mezcla líquido-vapor a volumen constante, la densidad del líquido disminuye y la del gas aumenta hasta que en el punto crítico éstas se igualan y la interfase que las separa desaparece. El fluido supercrítico formado tiene unas propiedades intermedias entre las propiedades de esa sustancia en estado líquido y entado gaseoso:

  • Su densidad es de 0’2 a 0’5 g/cm³. Es un valor elevado, próximo al del estado líquido, que aumenta rápidamente con la presión (lo que aumenta su capacidad disolvente y acorta los tiempos de elución). El incremento controlado de la presión causa un efecto similar al de la programación de la temperatura en la cromatografía de gases y la elución con gradiente en la HPLC. 
  • Los coeficientes de difusión son de 10 a 100 veces superiores a los del líquido (el ensanchamiento de banda es mayor que en los líquidos, pero menor que en los gases).
  • Las viscosidades son de 10 a 100 veces menores que las del líquido y comparables a las de los gases (permite tasas de flujo más elevadas, aumentando la velocidad de la separación).

La cromatografía de fluidos supercríticos es realmente una combinación de las técnicas de cromatografía de gases y las de cromatografía de líquidos. En ciertas aplicaciones es superior a la CG y la HPLC.

La instrumentación empleada en la cromatografía de fluidos supercríticos es similar a la de cromatografía de líquidos, aunque debe incorporar un sistema regulador de la presión y un horno termostato (similar al de cromatografía de gases, para controlar con precisión la temperatura de la fase móvil).

Aplicaciones

La SFC es una herramienta de gran importancia en la separación y determinación de compuestos para los que las cromatografías de gases o de líquidos no son adecuadas:

  • Compuestos no volátiles o termolábiles, que descomponen térmicamente antes de volatilizarse, por lo que la cromatografía de gases no se puede aplicar.
  • Compuestos sin grupos funcionales que puedan ser detectados mediante técnicas espectroscópicas o electroquímicas que se emplean en cromatografía de líquidos.

Los fluidos supercríticos son capaces de disolver moléculas grandes no volátiles (con masas moleculares varios órdenes de magnitud mayores que las que se manejan en la cromatografía de gases, aunque no tanto como las que pueden separarse mediante la cromatografía de exclusión por tamaño) y los solutos disueltos en ellos se pueden recuperar con facilidad dejando que las disoluciones se equilibren con la atmósfera a temperaturas relativamente bajas.

La cromatografía de fluidos supercríticos se aplica a un amplio conjunto de sustancias: productos naturales, fármacos, alimentos, plaguicidas, herbicidas, tensioactivos, aditivos, polímeros, explosivos…  La separación de estos compuestos se puede llevar a cabo a temperaturas inferiores a 100 ºC, por lo que no llegan a descomponerse.

Una aplicación importante de la SFC es la separación quiral o de enantiómeros, que se logra con una mayor resolución y en menor tiempo que con HPLC:

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Cromatografía en capa fina

Dentro de la cromatografía de líquidos distinguimos los métodos de cromatografía en columna y los métodos de cromatografía en superficie plana, en los que la fase móvil se desplaza por la fase estacionaria por acción capilar (a veces ayudada por la gravedad o por la aplicación de un potencial eléctrico). Entre estos últimos están la cromatografía en papel (CP) y la cromatografía en capa fina (TLC).

cromatografia-papel

Las primeras experiencias en cromatografía plana se llevaron a cabo en papel, siendo un método de gran importancia como técnica de separación a principios de los cincuenta, aunque actualmente está totalmente desplazada por la cromatografía en capa fina:

cromatografia-plana

Los soportes empleados están formados por placas delgadas de vidrio, plástico o metal con un fina película de material adherente que constituye la fase estacionaria. Dependiendo del rendimiento de la placa, el recubrimiento de la placa puede tener un espesor de 100 a 250 μm, con un tamaño de partícula que varía entre 5 y 20 μm, aproximadamente.

La muestra se aplica como un punto o banda a 1 o 2 cm del extremo de la placa y se deja secar. Este extremo se pone en contacto con la fase móvil en un recipiente cerrado y saturado con los vapores del disolvente empleado. La separación se produce por la migración diferencial de los componentes de la muestra en la dirección en la que se mueve la fase móvil.

Cuando los solutos son incoloros, una vez realizada la separación cromatográfica se deja secar la placa evaporando el disolvente y se procede al revelado de la misma, mediante un tratamiento químico que origine productos coloreados o fluorescentes.

Tipos de cromatografía en capa fina (TLC)

Dependiendo de la naturaleza del sólido extendido sobre la placa distinguimos:

  • TLC de partición: como soporte sólido inerte de la fase estacionaria líquida, que normalmente es de naturaleza polar (agua), se suele utilizar gel de sílice, celulosa o tierra de diatomeas.
  • TLC de adsorción: el sólido adsorbente es generalmente sílice o alúmina.
  • TLC de cambio iónico: se utiliza una resina intercambiadora de iones sobre la placa.
  • TLC de exclusión: se utiliza un material muy poroso pulverizado que origina fenómenos de exclusión según el tamaño molecular de los solutos (generalmente monosacáridos).

La mayoría de los fundamentos aplicados y los parámetros cromatográficos definidos para la cromatografía en columna se pueden aplicar, con ligeras modificaciones, a la cromatografía en capa fina.

Factor de retardo

El factor de retardo (RF) de un determinado analito se define como la relación entre la velocidad de desplazamiento del soluto y la velocidad de desplazamiento de la fase móvil. En un determinado instante, el factor de retardo puede definirse como una relación de distancias:

Factor-de-retardo

El factor de retardo varía desde 1 para los solutos que no se retrasan, hasta valores que se aproximan a 0.

Factor de retención en TLC

Son de aplicación todos las definiciones y ecuaciones generales de cromatografía, aunque podemos redefenir algunas de ellas:

parametros-cromatografia-capa-fina

Altura de plato en TLC

Al igual que en la cromatografía en columna, la eficacia del proceso cromatográfico viene dada por el número de platos teóricos (N) y la altura de plato teórico (H). Cada analito origina una mancha que se caracteriza por su anchura y su factor de retardo, por lo que podemos definir:

Altura-plato-numero-platos-cromatografia-capa-fina

Resolución en TLC

En la mayoría de las ocasiones las manchas que se obtienen para los distintos componentes de una muestra presentan una misma anchura, por lo que la resolución de la separación de dos analitos A y B por cromatografía plana será:

resolucion-cromatografia-capa-fina

Aplicaciones de la cromatografía en capa fina

La cromatografía en capa fina es muy útil a la hora de elegir la fase móvil apropiada para las separaciones en cromatografía de líquidos de alta eficacia, mediante sencillos y rápidos experimentos de ensayo y error.

La cromatografía HPLC es un método rápido y altamente automatizado, por lo que su uso se ha extendido y ha desplazado a la cromatografía en capa fina. Aunque todavía tiene amplio uso en los laboratorios clínicos y es la estructura de apoyo de muchos estudios bioquímicos y biológicos. Se puede aplicar tanto en la identificación cualitativa de compuestos como en el análisis cuantitativo.

Las diferencias entre cromatografía en columna y cromatografía plana se analizan en el ejercicio 5.