Instrumentación en la cromatografía de fluidos supercríticos

La instrumentación empleada en la cromatografía de fluidos supercríticos es similar a la de cromatografía de líquidos, aunque debe incorporar un horno termostato (similar al de cromatografía de gases, para controlar con precisión la temperatura de la fase móvil) y un restrictor o un sistema de contrapresión (que sirve para mantener la presión de la columna en el nivel deseado y para convertir el eluato a gas y arrastrarlo al detector):

schema-preparative-SFC

Un restrictor típico consiste en un capilar de 2 a 10 cm de longitud y de 5 a 10 μm de diámetro unido al extremo final de la columna. Son intercambiables, para ajustarse a distintas presiones y tasas de flujo.

Columnas cromatográficas en SFC

Debido a la baja viscosidad de los fluidos supercríticos, las columnas deben ser mucho más largas que las empleadas en cromatografía de líquidos. En cromatografía de fluidos supercríticos se emplean tanto las columnas capilares como las columnas de relleno:

  • Columnas capilares o tubulares abiertas: son de sílice fundida con recubrimientos internos (de un espesor de 0’05 a 1 μm) de varios tipos de siloxanos enlazados o entrecruzados, similares a las empleadas en cromatografía de gases, con longitudes que van desde los 10 a los 20 m y diámetros internos que oscilan entre 50 y 100 μm.
  • Columnas de relleno: son de acero inoxidable de 10 a 25 cm de largo, diámetros que varían entre 0’5 y 5 mm y cuyas partículas tienen un diámetro que oscila entre 3 y 10 μm. Son semejantes a las empleadas en cromatografía de reparto y proporcionan más platos teóricos (más de 100.000) y manejan volúmenes más grandes de muestra que las columnas capilares.

Fases móviles EN SFC

Las propiedades de algunos de los fluidos supercríticos empleados en SFC se recogen en la siguiente tabla:

fluidos-supercriticos-propiedades

La fase móvil más ampliamente utilizada en cromatografía de fluidos supercríticos es el dióxido de carbono:

  • Su temperatura crítica es de 31’3 ºC y su presión crítica es de 72’9 atm, por lo que puede ser utilizado en un amplio rango de temperaturas y presiones, que no superan los límites de operación de los actuales equipos de HPLC.
  • Es un disolvente excelente para una gran cantidad de moléculas orgánicas no polares.
  • Es inodoro y no es tóxico.
  • Es más económico y fácilmente disponible.
  • Es una sustancia transparente en el ultravioleta.

En algunas ocasiones se introducen modificadores orgánicos (como el metanol) en pequeñas concentraciones (1 %) para modificar los factores de selectividad (α) de los analitos.

Detectores en SFC

La principal ventaja de la cromatografía con fluidos supercríticos frente a la HPLC es que se pueden utilizar detectores de ionización de llama, como en la cromatografía de gases.

detector-ionizacion-llama

Este detector es de respuesta universal para compuestos orgánicos, de elevada sensibilidad y exento de problemas.

También pueden emplearse, como en la cromatografía de gases, detectores de absorción en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisión de fluorescencia, termoiónico y fotométrico de llama.

Los espectrómetros de masas también se pueden adaptar como detectores, más fácilmente que para HPLC.

Cromatografía de fluidos supercríticos

La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) emplea fluidos supercríticos como fase móvil. Un fluido supercrítico se forma cuando una sustancia se encuentra por encima de su presión y temperatura críticas (punto crítico):

fluido-supercritico

  • Temperatura crítica: es aquella a partir de la cual una sustancia no puede existir en fase líquida, independientemente de la presión.
  • Presión crítica: máxima presión a la cual un líquido puede ser convertido en un gas por incremento de la temperatura.

Al calentar una mezcla líquido-vapor a volumen constante, la densidad del líquido disminuye y la del gas aumenta hasta que en el punto crítico éstas se igualan y la interfase que las separa desaparece. El fluido supercrítico formado tiene unas propiedades intermedias entre las propiedades de esa sustancia en estado líquido y entado gaseoso:

  • Su densidad es de 0’2 a 0’5 g/cm³. Es un valor elevado, próximo al del estado líquido, que aumenta rápidamente con la presión (lo que aumenta su capacidad disolvente y acorta los tiempos de elución). El incremento controlado de la presión causa un efecto similar al de la programación de la temperatura en la cromatografía de gases y la elución con gradiente en la HPLC. 
  • Los coeficientes de difusión son de 10 a 100 veces superiores a los del líquido (el ensanchamiento de banda es mayor que en los líquidos, pero menor que en los gases).
  • Las viscosidades son de 10 a 100 veces menores que las del líquido y comparables a las de los gases (permite tasas de flujo más elevadas, aumentando la velocidad de la separación).

La cromatografía de fluidos supercríticos es realmente una combinación de las técnicas de cromatografía de gases y las de cromatografía de líquidos. En ciertas aplicaciones es superior a la CG y la HPLC.

La instrumentación empleada en la cromatografía de fluidos supercríticos es similar a la de cromatografía de líquidos, aunque debe incorporar un sistema regulador de la presión y un horno termostato (similar al de cromatografía de gases, para controlar con precisión la temperatura de la fase móvil).

Aplicaciones

La SFC es una herramienta de gran importancia en la separación y determinación de compuestos para los que las cromatografías de gases o de líquidos no son adecuadas:

  • Compuestos no volátiles o termolábiles, que descomponen térmicamente antes de volatilizarse, por lo que la cromatografía de gases no se puede aplicar.
  • Compuestos sin grupos funcionales que puedan ser detectados mediante técnicas espectroscópicas o electroquímicas que se emplean en cromatografía de líquidos.

Los fluidos supercríticos son capaces de disolver moléculas grandes no volátiles (con masas moleculares varios órdenes de magnitud mayores que las que se manejan en la cromatografía de gases, aunque no tanto como las que pueden separarse mediante la cromatografía de exclusión por tamaño) y los solutos disueltos en ellos se pueden recuperar con facilidad dejando que las disoluciones se equilibren con la atmósfera a temperaturas relativamente bajas.

La cromatografía de fluidos supercríticos se aplica a un amplio conjunto de sustancias: productos naturales, fármacos, alimentos, plaguicidas, herbicidas, tensioactivos, aditivos, polímeros, explosivos…  La separación de estos compuestos se puede llevar a cabo a temperaturas inferiores a 100 ºC, por lo que no llegan a descomponerse.

Una aplicación importante de la SFC es la separación quiral o de enantiómeros, que se logra con una mayor resolución y en menor tiempo que con HPLC:

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Introducción a las técnicas cromatográficas

Definición de cromatografía

Según la IUPAC, la cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar son distribuidos entre dos fases, una de las cuales permanece estacionaria mientras que la otra se mueve en una dirección determinada.

Por lo tanto, en cualquier proceso cromatográfico distinguimos:

  • Una fase móvil (FM), que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico, en la que va disuelta la muestra.
  • Una fase estacionaria (FE) inmiscible, la cual se mantiene fija sobre una columna o sobre una superficie sólida.

Los componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven con mayor lentitud en la fase móvil, mientras que aquellos que se unen débilmente a la fase estacionaria se mueven con mayor rapidez. Esta diferencia de velocidades en el seno de la fase móvil permite la separación y el análisis cualitativo o cuantitativo de los componentes.

Clasificación de los métodos cromatográficos

Según la forma de contacto entre la FM y la FE:

  • Cromatografía en columna: la FE se introduce en una columna estrecha a través de la cual pasa la FM por efecto de la gravedad o de una presión aplicada.

cromatografia-columna

  • Cromatografía plana: la FE se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel y la FM se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad.

cromatografia-plana

Según el estado físico de la FM:

  • Cromatografía de líquidos: la fase móvil es un líquido. Distinguimos la cromatografía líquido-líquido o de reparto (la FE es un líquido), la cromatografía líquido-sólido o de adsorción (la FE es un sólido), la cromatografía de intercambio iónico (la FE es una resina intercambiadora de iones), la cromatografía de exclusión por tamaño (la FE es un líquido en los intersticios de un sólido polimérico) o la cromatografía de afinidad (la FE es un grupo de líquidos específicos unidos a una superficie sólida).
  • Cromatografía de gases: la fase móvil es un gas. Distinguimos la cromatografía de gas-líquido (la FE es un líquido adsorbido o unido a una superficie sólida) o la cromatografía gas-sólido (la FE es un sólido).
  • Cromatografía de fluidos supercríticos: la fase móvil es un fluido supercrítico (la FE está compuesta por moléculas orgánicas enlazadas a una superficie sólida).

Cromatografía de elución en Columna

La elución implica el transporte de una especie a través de una columna por la adición de nueva fase móvil:

eluato

Inicialmente se introduce una cierta cantidad de muestra diluida en FM. Al ir añadiendo FM nueva, el eluyente (la parte de la muestra contenida en en la FM) desciende por la columna, donde tiene lugar un reparto o distribución entre la FM y la FE, en una serie continua de transferencias entre las dos fases. Según sea el coeficiente de reparto, los solutos estarán más o menos tiempo en la fase móvil, que es la que consigue hacerlos avanzar. Por tanto, cuanto más tiempo pasen en la fase móvil, más rápidamente se moverán. Los solutos que presenten una mayor afinidad por la FE quedarán más tiempo retenidos, por lo que avanzarán a menor velocidad.

La diferencia en la velocidad de desplazamiento de los solutos o analitos permite su separación en zonas o bandas a lo largo de la columna. A medida que se va añadiendo más FM a la columna, las bandas van llegando individualmente al final de la columna y son eluidas. La fracción eluida se denomina eluato.

Si al final de la columna se coloca un detector que responde a la concentración del soluto y se registra su señal en función del tiempo (o del volumen de FM añadido) se obtiene un cromatograma. Lógicamente, el proceso de separación produce una dilución considerable del analito, por lo que los detectores empleados deben ser más sensibles que los que serían necesarios si el proceso de separación no fuera imprescindible.