Cromatografía de intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico o cromatografía iónica (IC) es una cromatografía de líquidos en la que como fase estacionaria se emplea una resina de intercambio iónico, de elevada masa molecular y esencialmente insoluble.

Los procesos de intercambio iónico se basan en los equilibrios de intercambio iónico entre los iones de una disolución y los iones del mismo signo que se encuentran en la superficie de la resina.

resina-intercambio-cationico

Los rellenos tradicionales empleados están formados por pequeñas partículas esféricas y porosas compuestas por polímeros entrecruzados (de estireno y divinilbenceno) que poseen grupos funcionales ácidos o básicos unidos químicamente:

Figure12.49

  • Las resinas de intercambio catiónico presentan grupos de ácido sulfónico (ácido fuerte) o grupos de ácido carboxílico (ácido débil):

resinas-intercambio-cationica

  • Las resinas de intercambio aniónico contienen grupos amino terciarios (muy básicos) o grupos amino primarios (bases débiles):

resinas-intercambio-anionico

Como ejemplo, la aplicación de la ley de acción de masas al equilibrio de intercambio catiónico en una resina con grupos sulfónicos:

Constante-distribucion-intercambio-ionico

La constante representa la afinidad de la resina por los iones:

afinidad-iones-columnas-relleno-intercambio

Un inconveniente de las partículas poliméricas porosas es la baja velocidad de difusión de las partículas de analito. Para ello se han desarrollado dos nuevos tipos de relleno más efectivos:

  • Uno es un relleno en la que la superficie de una partícula esférica no porosa se recubre con una resina sintética de intercambio iónico.
  • Otro es un relleno de micropartículas porosas de sílice recubiertas con una delgada película de intercambiador.

Fases móviles en cromatografía de intercambio iónico

De manera general, las fases móviles en cromatografía tienen las siguientes características:

  • Deben poder disolver la muestra y tener una fuerza disolvente que proporcione tiempos de retención razonables (valores de k adecuados).
  • Deben interactuar con los solutos de tal forma que favorezcan la selectividad (valores de α adecuados).

Las fases móviles empleadas suelen ser soluciones acuosas con cierta cantidad de algún disolvente orgánico miscible (como el metanol). En general, los iones de la fase móvil compiten con los del analito por los puntos activos del relleno del intercambiador iónico. El tipo y proporción de los disolventes en la fase móvil determinarán su fuerza y su selectividad.

Aplicaciones de la cromatografía iónica

La cromatografía de intercambio iónico se emplea tanto en la separación de especies inorgánicas como en la separación de compuestos orgánicos.

determinacio-aguas-consumo

La aplicación de la cromatografía iónica al análisis de especies inorgánicas tuvo problemas en sus inicios debido a la falta de un buen sistema de detección de carácter universal. Obviamente, el detector más adecuado para la determinación de especies iónicas es el detector de conductividad, ya que son sencillos, económicos, fáciles de manejar y responden de manera predecible a todas las especies con carga. Sin embargo, la fase móvil presenta una elevada conductividad y tiende a enmascarar al analito, reduciendo la sensibilidad del detector.

Para solucionar este problema se ideó la cromatografía iónica con inhibidores (o supresores) que añade una columna inhibidora del eluyente a continuación de la columna analítica. La columna inhibidora (o supresora) se rellena con una segunda resina de intercambio iónico que convierte los iones del disolvente en especies moleculares poco ionizadas, sin alterar los iones del analito.

Por ejemplo, en la separación de cationes con frecuencia se emplea ácido clorhídrico como eluyente, de modo que la columna inhibidora es una resina de intercambio aniónico en la forma de hidróxido que lo neutraliza formando agua. Cuando se efectúa una separación de aniones, el relleno inhibidor es la forma ácida de una resina de intercambio catiónico y bicarbonato de sodio o carbonato como agente eluyente. Las columnas inhibidoras deben regenerarse para no perder su efectividad.

La cromatografía iónica se ha aplicado a una gran variedad de sistemas orgánicos y bioquímicos, incluyendo fármacos, conservantes alimentarios, azúcares y vitaminas, entre otros.

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Separación de aminoácidos mediante una columna de intercambio iónico.

Cromatografía de adsorción

La cromatografía de adsorción es la forma clásica de cromatografía ideada por Tswett por primera vez en 1903, con la que logró separar diferentes pigmentos vegetales.

Tswett_01

En la cromatografía de adsorción o cromatografía líquido-sólido, la fase estacionaria es un sólido, habitualmente sílice, aunque en algunas ocasiones se emplea alúmina finamente dividida. Las características de absorción en ambas columnas son similares y en ambas los tiempos de retención se alargan a medida que la polaridad del analito aumenta. El analito queda retenido en la fase estacionaria mediante fenómenos de adsorción.

El fundamento de la cromatografía de adsorción es similar al de la cromatografía de reparto en fase normal (de hecho el reparto muchas veces se debe a la adsorción). En este caso, el índice de polaridad descrito para la cromatografía de reparto también puede servir de orientación, sin embargo, en cromatografía de adsorción es más conveniente aplicar la denominada fuerza eluyente (εº) de los disolventes , que es la energía de adsorción por unidad de área. Los valores de εº de los disolventes dependen del adsorbente empleado como fase estacionaria, y para la sílice son 0’8 veces mayores que para la alúmina.

Aunque se ha extendido más el uso de la cromatografía de reparto en fase normal, la cromatografía de adsorción se emplea fundamentalmente para la separación de compuestos no polares de bajo peso molecular. Una característica particular de la cromatografía de adsorción es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros de mezclas.

cromatografia-adsorcion-isomeros

Cromatografía de reparto

La cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) más empleada en la actualidad es la cromatografía de reparto, en la cual la fase estacionaria es un líquido retenido sobre un soporte sólido y la separación se debe a la diferente distribución del analito entre la fase móvil y la fase estacionaria:

  • Cromatografía líquido-líquido: la fase estacionaria líquida se retiene en las partículas de relleno mediante adsorción física.
  • Cromatografía de fase unida químicamente: la fase estacionaria establece enlaces con la superficie del soporte.

La primera resulta problemática en la elución en gradiente y por pérdida de fase estacionaria, por lo que la cromatografía de fase unida químicamente es la más utilizada.

Los soportes empleados suelen estar formados por partículas de sílice, resistentes, porosas y con un diámetro de unos 3-5 μm. Su superficie está formada por grupos silanol químicamente reactivos:

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Los recubrimientos más utilizados son los siloxanos, formados por reacción de los grupos silanol con un organoclorosilano.

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Cuando la reacción se produce con un grupo alquilo de mayor tamaño, los efectos estéricos impiden que todos los grupos silanol reaccionen, afectando al resultado de la separación. Para reducir este efecto, los grupos silanol libres se desactivan haciéndolos reaccionar con clorotrimetilsilano, que debido a su pequeño tamaño puede unirse químicamente a muchos de ellos.

silanol

La polaridad de la fase estacionaria y, por lo tanto, sus propiedades para la separación dependen de la naturaleza del organoclorosilano empleado (de su grupo alquilo R).

Fase normal y fase inversa

Según sea la relación entre las polaridades relativas de las fases móvil y estacionaria distinguimos:

  • Cromatografía de reparto en fase normal: la fase móvil es un disolvente apolar o poco polar (como el hexano o el isopropiléter) y la fase estacionaria presenta elevada polaridad (el grupo R es polar).
  • Cromatografía de reparto en fase inversa: la fase móvil es un disolvente relativamente polar (disoluciones acuosas con etanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano) y la fase estacionaria es apolar (el grupo R es un n-octilo, C8, o n-octadecilo, C18). La longitud de la cadena del grupo alquilo influye en la eficacia de la separación, pues a mayor longitud mayores serán el tiempo de retención y el tamaño de partícula capaz de retener.

En cromatografía en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que relativamente es el más soluble en la fase móvil y un aumento de la polaridad de la misma provoca una disminución del tiempo de elución. Por el contrario, en fase inversa, los componentes más polares aparecen primero, y un aumento de la polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución.

cromatografia-reparto-fase-normal-fase-inversa

La elección de la composición de la fase móvil no es sencilla. Debemos tener en cuenta múltiples factores:

  • Orden polaridad: hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas < aminas < alcoholes < agua
  • Habitualmente la polaridad de la fase estacionaria es distinta de la de los analitos y para la elución se emplea una fase móvil con una polaridad considerablemente distinta.
  • Podemos mejorar la separación manipulando el factor de retención (k), variando la composición de la fase móvil, de manera que su valor se encuentre en el intervalo comprendido entre 2 y 10.
  • También podemos recurrir si es necesario a variar el factor de selectividad (α), cambiando la naturaleza química de la fase móvil, pero manteniendo el factor de retención en los valores apropiados.
  • Es útil el concepto de índice de polaridad (P’), que es una medida numérica de la polaridad de un disolvente (oscila entre –2, para los fluoroalcanos, que son muy poco polares, hasta 10’2, para el agua, muy polar). El índice de polaridad de una mezcla de disolventes A y B se calcula:

cromatografia-reparto-indice-polaridad

En general, se comprueba que un cambio de dos unidades de P’ origina aproximadamente una variación de 10 veces en la constante de reparto k:

cromatografia-reparto-indice-polaridad-constante-k

Comprueba la utilidad de estas expresiones en el ejercicio 3.

Aplicaciones de la cromatografía de reparto

Son muchos los campos de aplicación que presenta la cromatografía de reparto para la separación de diferentes analitos, especialmente mediante cromatografía de fase inversa con fases unidas químicamente:

  • Farmacología: antibióticos, sedantes, esteroides, analgésicos…
  • Bioquímica: aminoácidos, proteínas, glúcidos, lípidos, metabolitos…
  • Alimentación: edulcorantes, antioxidantes, aditivos, aflatoxinas…
  • Industria química: aromáticos, condensados, tensioactivos, propulsores, colorantes…
  • Contaminantes: pesticidas, herbicidas, fenoles, PCB…
  • Medicina clínica y forense: venenos, drogas, alcohol en sangre, extractos de orina, estrógenos…

En algunos casos, es conveniente transformar los componentes de la muestra en un compuesto derivado, de manera que se reduzca su polaridad, se aumente la sensibilidad o la selectividad de la respuesta del detector.

Detectores empleados en HPLC

Los detectores empleados en HPLC se han diseñado, adaptado y perfeccionado con el fin de incorporar celdas de flujo que permitan medir las bajas concentraciones de analito que hay en el líquido. Los distintos detectores se clasifican según se encarguen de medir una propiedad del soluto o de la disolución.

Detector de absorción UV-visible

El flujo de líquido que sale de la columna pasa a través de una pequeña celda, de pequeño volumen (entre 1 a 10 μL), para minimizar el ensanchamiento de banda. La medida de la absorbancia del líquido que la atraviesa en función del tiempo constituye el cromatograma. Su límite de detección oscila entre 0’1 y 1 ng y puede emplearse en cromatografía de elución en gradiente.

detector-absorbancia-UV-HPLC

  • Fotómetro de filtro: es el detector de absorción UV más sencillo. Emplea una lámpara de mercurio como fuente y una serie de filtros para aislar la intensa línea a 254 nm, con la que se mide la absorbancia (variando los filtros se pueden seleccionar otras líneas).
  • Espectrómetro de barrido: permite realizar el análisis seleccionando una o varias longitudes de onda en la región de interés.
  • Espectrómetro de arreglos de diodos: debido a su rapidez, son capaces de registrar la totalidad del espectro proporcionando un cromatograma tridimensional que muestra la absorbancia en función de la longitud de onda cada pequeños intervalos de tiempo.

Cromatograma-3D-a

DETECTOR de absorción infrarroja

Las celdas empleadas en estos detectores son similares a las empleadas en los detectores de absorción UV-vis, excepto por las ventanas ópticas, que en este caso son de cloruro de sodio o de fluoruro de calcio.

Se emplea en aquellos analitos que absorben radiación infrarroja (IR, cuya longitud de onda supera los 700 nm), por lo que se debe prestar atención al disolvente utilizado, ya que muchos de ellos también absorben estas radiaciones.

Los detectores más sofisticados se basan en instrumentos de transformada de Fourier (FTIR). El límite de detección es de 1.000 ng y también pueden emplearse en cromatografía de elución en gradiente.

DETECTOR DE Fluorescencia

Se basan en la capacidad de algunos solutos capaces de emitir fluorescencia, o de aquellos que no lo son pero pueden hacerlo tras un tratamiento adecuado (derivatización).

Los más sencillos emplean una fuente de excitación de mercurio y uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente. Los instrumentos más sofisticados consisten en una fuente de radiación de xenón y emplean un monocromador de red para aislar la radiación fluorescente.

Son muy sensibles, siendo su límite de detección de 0’001-0’01 ng y también se pueden utilizar en elución con gradiente.

DETECTOR DE índice de refracción

En este caso miden una propiedad de la disolución, como es la variación en su índice de refracción como consecuencia de la presencia de un soluto.

Este tipo de detectores constan de una cubeta con dos compartimentos separados por una placa de vidrio, por uno de los cuales solamente pasa fase móvil, como referencia, y por el otro pasa el eluato que abandona la columna y que contiene la muestra. Sobre la cubeta se irradia un haz de luz que se desvía cuando la muestra aparece en el líquido eluido de la columna.

Son detectores universales y no dependen del caudal de fase móvil. Sin embargo, no pueden emplearse en elución con gradiente, sus medidas se ven afectadas por los cambios de temperatura y no son tan sensibles. Su límite de detección se sitúa entre 100 y 1.000 ng.

DETECTOR DE Dispersión de luz

La dispersión se produce por la interacción de la radiación electromagnética con la materia. El eluato que abandona la columna se nebuliza mediante un flujo de nitrógeno o de aire y se vaporiza la fase móvil, quedando únicamente unas finas gotitas de soluto sin evaporar. La nube de partículas de analito pasa a través de un haz de láser y la dispersión producida es detectada por un fotodiodo de silicio.

Este detector responde a todos los solutos menos volátiles que la fase móvil y su límite de detección se encuentra entre 0’1 y 1 ng.

detector-dispersion-luz

DETECTOR electroquímico

Este tipo de detectores responden a analitos susceptibles de reducirse u oxidarse, como fenoles, aminas aromáticas, peróxidos, cetonas, aldehídos, compuestos halogenados, nitroderivados…

Un ejemplo de detector electroquímico es el detector amperométrico, basado en la oxidación o reducción del eluato en un electrodo de trabajo:

detector-amperometrico

En este electrodo se mantiene el potencial a un valor seleccionado, respecto a un electrodo de referencia (Ag/AgCl) y se mide la corriente que pasa entre el electrodo de trabajo y un electrodo auxiliar, de acero inoxidable, en función del tiempo. Para solutos oxidables, son comunes los electrodos de cobre o de carbón vitrificado. Para solutos reducibles, un buen electrodo de trabajo es el de gotas de mercurio.

La corriente es proporcional a la concentración del soluto en un intervalo de seis órdenes de magnitud. Con este detector se debe trabajar en rigurosa ausencia de oxígeno y con disoluciones acuosas, o de disolventes polares, que contengan electrolitos. Presentan una gran sensibilidad, con un límite de detección entre 0’01 y 1 ng. Sin embargo, no pueden ser empleados en elución con gradiente, y dependen de la temperatura y del caudal.

DETECTOR DE conductividad

Estos detectores se basan en los cambios de conductividad de la fase móvil en presencia de moléculas de analito. Están formados por una celda asilada que contiene dos electrodos sobre los que se aplica una diferencia de potencial, de manera que se mide la resistencia que ofrece la mezcla eluida, la cual está relacionada con su concentración.

Este detector es útil para la determinación de analitos iónicos. Su límite de detección se encuentra entre 0’5 y 1 ng. es sensible a los cambios de temperatura y no puede emplearse en elución en gradiente.

DETECTOR acoplado a espectrómetro de masas

El principal problema que surge al acoplar un espectrómetro de masas al cromatógrafo HPLC es la enorme cantidad de disolvente que acompaña al analito, para lo cual se han desarrollado diversas interfases:

  • Termovaporizador (termospray): con esta interfase se vaporiza el eluato y se forma un aerosol, formado por moléculas de disolvente y de analito. Mediante un mecanismo de ionización química, se ioniza el analito y los iones son conducidos hacia el espectrómetro y el disolvente es expulsado mediante una bomba. Los analitos deben ser termoestables y polares.
  • Interfase de ionización química a presión atmosférica (APCI): utiliza calefacción y nitrógeno para convertir el eluato en aerosol, del que se evapora el disolvente. Mediante una descarga eléctrica el analito se convierte en iones que son conducidos hacia el espectrómetro de masas.
  • Interfase de ionización por electronebulización (electrospray): el eluato pasa a través de un capilar metálico, en cuya salida se aplica un fuerte campo eléctrico a la vez que una corriente coaxial de nitrógeno gaseoso, con lo que se crea un fino aerosol de partículas cargadas.

Ensanchamiento de banda extracolumna en HPLC

El ensanchamiento de banda extracolumna (no provocado por la propia columna o su relleno) tiene lugar cuando se transporta la muestra a través de tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyección, en los detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes de cualquier sistema instrumental empleado en la cromatografía HPLC.

El ensanchamiento tiene su origen en las diferencias en las velocidades en el interior del fluido, ya que la parte central de una banda se mueve más rápidamente que las capas de líquido adyacentes a las paredes del tubo. En cromatografía de gases, este hecho se ve compensado por la elevada difusión de los propios gases. Sin embargo, en los líquidos la difusión es mucho menor y el ensanchamiento se hace más evidente.

La contribución a la altura total de los platos viene dada por:

ensanchamiento-banda-extracolumna

Según esto, en tubos de diámetro muy pequeño el ensanchamiento de banda extracolumna puede ser muy importante, por lo que la longitud del tubo fuera de la columna se hace tan pequeña como sea posible.