Cromatografía por afinidad

La cromatografía por afinidad es un tipo de cromatografía de líquidos que se basa en la unión reversible entre el analito de interés y un ligando específico, inmovilizado en un soporte sólido inerte. Cuando la muestra pasa por la columna, sólo son retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad y las que no se unen avanzan con la fase móvil. Después, los analitos retenidos pueden ser arrastrados cambiando las condiciones de la fase móvil.

cromatografía-afinidad

Las matrices o soportes empleados en cromatografía de afinidad como fase estacionaria deben ser rígidos, resistentes, insolubles, permeables y reactivos. Suelen ser de dos tipos:

  • Matrices de polisacáridos (agarosa, celulosa, dextrano)
  • Matrices sintéticas (vidrio, poliacrilamida)

Los ligandos por afinidad característicos son anticuerpos, inhibidores de enzimas, o compuestos más generales, como las lectinas (que se enlazan a polisacáridos). Se fijan mediante enlaces covalentes a la fase estacionaria químicamente activada.

La fase móvil desempeña dos funciones distintas:

  • Debe soportar el fuerte enlace entre las moléculas del analito y el ligando
  • Debe ser capaz de debilitar o eliminar la unión entre el analito y el ligando, una vez se han eliminado las especies indeseables, de modo que el analito pueda ser eluido.

Según la naturaleza de los ligandos y los analitos distinguimos dos procedimientos generales de elución:

  • Elución bioespecífica: la fase móvil contiene un inhibidor por el que el analito tiene preferencia (compite con el ligando). El analito se retira entonces del ligando y es eluido.
  • Elución no específica: la fase móvil provoca un cambio en el sitio activo del ligando, mediante variaciones del pH, de la constante dieléctrica o de la fuerza iónica del medio. También se puede desnaturalizar el ligando mediante reacciones químicas con urea o tiocianato potásico.

Aplicaciones de la cromatografía de afinidad

La cromatografía por afinidad es muy específica y su mayor campo de aplicación se encuentra en la purificación o aislamiento de sustancias de naturaleza biológica, como proteínas o ácidos nucleicos.

Se utiliza principalmente con fines preparativos en análisis cuantitativos, pues permite aislar con rapidez biomoléculas en estudios bioquímicos.

Cromatografía de exclusión por tamaño

La cromatografía de exclusión por tamaño o de gel es un tipo de cromatografía de líquidos en la que la fase estacionaria es un material poroso que permite la elución diferencial de los solutos en función de sus tamaños moleculares.

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A diferencia de otros métodos cromatográficos, en la cromatografía de exclusión por tamaño no hay interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria.

Los rellenos empleados en cromatografía de exclusión por tamaño deben ser inertes, estables, resistentes y con un tamaño de partícula y de poro uniformes. Están compuestos por pequeñas partículas de sílice o de polímeros, con un diámetro entre 5 y 10 μm, que tienen una red de poros donde se quedan atrapadas las moléculas de soluto. Los analitos de mayor tamaño no son retenidos por lo que son excluidos y se eluyen con rapidez. Los que tienen tamaños menores que los de los poros pueden penetrar en ellos y son retenidos por más tiempo.

Características de las partículas de sílice:

  • Gran rigidez (permite la aplicación de altas presiones)
  • Mayor estabilidad (favorece el uso de una gran variedad de disolventes, incluida el agua)
  • Regulación rápida al cambiar de disolvente
  • Estabilidad a elevadas temperaturas
  • Inconveniente: tendencia a retener solutos por adsorción y capacidad para catalizar la descomposición de las moléculas de soluto.

Características de los rellenos poliméricos:

  • Copolímeros de estireno y divinilbenceno entrecruzados.
  • El tamaño de poro es fácilmente controlable según el grado de entrecruzamiento y, por tanto, de la proporción de divinilbenceno.
  • Son hidrófobos.
  • En la actualidad se fabrican geles hidrofílicos, compuestos por poliacrilamidas o polímeros sulfonados de divinilbenceno, con los que se pueden emplear disolventes acuosos.

Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaño

Distinguimos dos métodos:

  • Cromatografía de filtración sobre gel: emplea disolventes acuosos y rellenos hidrofílicos.
  • Cromatografía de penetrabilidad sobre gel: emplea disolventes orgánicos no polares y rellenos hidrofóbicos.

La cromatografía de exclusión por tamaño es de gran utilidad en la separación de compuestos de elevado peso molecular (proteínas, polímeros, ácidos grasos, glúcidos).

La masa molecular máxima por encima de la cual el analito ya no es retenido por un determinado relleno se conoce como límite de exclusión:

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Las ventajas de los procedimientos de exclusión por tamaño son:

  • Tiempos de separación cortos y muy bien definidos
  • Bandas estrechas que permiten una buena sensibilidad
  • No hay pérdida de muestra porque los solutos no interaccionan con la fase estacionaria
  • No se desactiva la columna por la interacción del soluto con el relleno

Sin embargo, entre las desventajas encontramos:

  • Sólo una cantidad limitada de bandas se pueden acomodar porque la escala de tiempo del cromatograma es corta
  • Inaplicabilidad en muestras con analitos de dimensiones similares (como los isómeros). En general, se requiere una diferencia de 10 % en las masas moleculares para conseguir una resolución razonable.

Cromatografía de intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico o cromatografía iónica (IC) es una cromatografía de líquidos en la que como fase estacionaria se emplea una resina de intercambio iónico, de elevada masa molecular y esencialmente insoluble.

Los procesos de intercambio iónico se basan en los equilibrios de intercambio iónico entre los iones de una disolución y los iones del mismo signo que se encuentran en la superficie de la resina.

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Los rellenos tradicionales empleados están formados por pequeñas partículas esféricas y porosas compuestas por polímeros entrecruzados (de estireno y divinilbenceno) que poseen grupos funcionales ácidos o básicos unidos químicamente:

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  • Las resinas de intercambio catiónico presentan grupos de ácido sulfónico (ácido fuerte) o grupos de ácido carboxílico (ácido débil):

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  • Las resinas de intercambio aniónico contienen grupos amino terciarios (muy básicos) o grupos amino primarios (bases débiles):

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Como ejemplo, la aplicación de la ley de acción de masas al equilibrio de intercambio catiónico en una resina con grupos sulfónicos:

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La constante representa la afinidad de la resina por los iones:

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Un inconveniente de las partículas poliméricas porosas es la baja velocidad de difusión de las partículas de analito. Para ello se han desarrollado dos nuevos tipos de relleno más efectivos:

  • Uno es un relleno en la que la superficie de una partícula esférica no porosa se recubre con una resina sintética de intercambio iónico.
  • Otro es un relleno de micropartículas porosas de sílice recubiertas con una delgada película de intercambiador.

Fases móviles en cromatografía de intercambio iónico

De manera general, las fases móviles en cromatografía tienen las siguientes características:

  • Deben poder disolver la muestra y tener una fuerza disolvente que proporcione tiempos de retención razonables (valores de k adecuados).
  • Deben interactuar con los solutos de tal forma que favorezcan la selectividad (valores de α adecuados).

Las fases móviles empleadas suelen ser soluciones acuosas con cierta cantidad de algún disolvente orgánico miscible (como el metanol). En general, los iones de la fase móvil compiten con los del analito por los puntos activos del relleno del intercambiador iónico. El tipo y proporción de los disolventes en la fase móvil determinarán su fuerza y su selectividad.

Aplicaciones de la cromatografía iónica

La cromatografía de intercambio iónico se emplea tanto en la separación de especies inorgánicas como en la separación de compuestos orgánicos.

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La aplicación de la cromatografía iónica al análisis de especies inorgánicas tuvo problemas en sus inicios debido a la falta de un buen sistema de detección de carácter universal. Obviamente, el detector más adecuado para la determinación de especies iónicas es el detector de conductividad, ya que son sencillos, económicos, fáciles de manejar y responden de manera predecible a todas las especies con carga. Sin embargo, la fase móvil presenta una elevada conductividad y tiende a enmascarar al analito, reduciendo la sensibilidad del detector.

Para solucionar este problema se ideó la cromatografía iónica con inhibidores (o supresores) que añade una columna inhibidora del eluyente a continuación de la columna analítica. La columna inhibidora (o supresora) se rellena con una segunda resina de intercambio iónico que convierte los iones del disolvente en especies moleculares poco ionizadas, sin alterar los iones del analito.

Por ejemplo, en la separación de cationes con frecuencia se emplea ácido clorhídrico como eluyente, de modo que la columna inhibidora es una resina de intercambio aniónico en la forma de hidróxido que lo neutraliza formando agua. Cuando se efectúa una separación de aniones, el relleno inhibidor es la forma ácida de una resina de intercambio catiónico y bicarbonato de sodio o carbonato como agente eluyente. Las columnas inhibidoras deben regenerarse para no perder su efectividad.

La cromatografía iónica se ha aplicado a una gran variedad de sistemas orgánicos y bioquímicos, incluyendo fármacos, conservantes alimentarios, azúcares y vitaminas, entre otros.

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Separación de aminoácidos mediante una columna de intercambio iónico.

Cromatografía de adsorción

La cromatografía de adsorción es la forma clásica de cromatografía ideada por Tswett por primera vez en 1903, con la que logró separar diferentes pigmentos vegetales.

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En la cromatografía de adsorción o cromatografía líquido-sólido, la fase estacionaria es un sólido, habitualmente sílice, aunque en algunas ocasiones se emplea alúmina finamente dividida. Las características de absorción en ambas columnas son similares y en ambas los tiempos de retención se alargan a medida que la polaridad del analito aumenta. El analito queda retenido en la fase estacionaria mediante fenómenos de adsorción.

El fundamento de la cromatografía de adsorción es similar al de la cromatografía de reparto en fase normal (de hecho el reparto muchas veces se debe a la adsorción). En este caso, el índice de polaridad descrito para la cromatografía de reparto también puede servir de orientación, sin embargo, en cromatografía de adsorción es más conveniente aplicar la denominada fuerza eluyente (εº) de los disolventes , que es la energía de adsorción por unidad de área. Los valores de εº de los disolventes dependen del adsorbente empleado como fase estacionaria, y para la sílice son 0’8 veces mayores que para la alúmina.

Aunque se ha extendido más el uso de la cromatografía de reparto en fase normal, la cromatografía de adsorción se emplea fundamentalmente para la separación de compuestos no polares de bajo peso molecular. Una característica particular de la cromatografía de adsorción es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros de mezclas.

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Cromatografía de reparto

La cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) más empleada en la actualidad es la cromatografía de reparto, en la cual la fase estacionaria es un líquido retenido sobre un soporte sólido y la separación se debe a la diferente distribución del analito entre la fase móvil y la fase estacionaria:

  • Cromatografía líquido-líquido: la fase estacionaria líquida se retiene en las partículas de relleno mediante adsorción física.
  • Cromatografía de fase unida químicamente: la fase estacionaria establece enlaces con la superficie del soporte.

La primera resulta problemática en la elución en gradiente y por pérdida de fase estacionaria, por lo que la cromatografía de fase unida químicamente es la más utilizada.

Los soportes empleados suelen estar formados por partículas de sílice, resistentes, porosas y con un diámetro de unos 3-5 μm. Su superficie está formada por grupos silanol químicamente reactivos:

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Los recubrimientos más utilizados son los siloxanos, formados por reacción de los grupos silanol con un organoclorosilano.

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Cuando la reacción se produce con un grupo alquilo de mayor tamaño, los efectos estéricos impiden que todos los grupos silanol reaccionen, afectando al resultado de la separación. Para reducir este efecto, los grupos silanol libres se desactivan haciéndolos reaccionar con clorotrimetilsilano, que debido a su pequeño tamaño puede unirse químicamente a muchos de ellos.

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La polaridad de la fase estacionaria y, por lo tanto, sus propiedades para la separación dependen de la naturaleza del organoclorosilano empleado (de su grupo alquilo R).

Fase normal y fase inversa

Según sea la relación entre las polaridades relativas de las fases móvil y estacionaria distinguimos:

  • Cromatografía de reparto en fase normal: la fase móvil es un disolvente apolar o poco polar (como el hexano o el isopropiléter) y la fase estacionaria presenta elevada polaridad (el grupo R es polar).
  • Cromatografía de reparto en fase inversa: la fase móvil es un disolvente relativamente polar (disoluciones acuosas con etanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano) y la fase estacionaria es apolar (el grupo R es un n-octilo, C8, o n-octadecilo, C18). La longitud de la cadena del grupo alquilo influye en la eficacia de la separación, pues a mayor longitud mayores serán el tiempo de retención y el tamaño de partícula capaz de retener.

En cromatografía en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que relativamente es el más soluble en la fase móvil y un aumento de la polaridad de la misma provoca una disminución del tiempo de elución. Por el contrario, en fase inversa, los componentes más polares aparecen primero, y un aumento de la polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución.

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La elección de la composición de la fase móvil no es sencilla. Debemos tener en cuenta múltiples factores:

  • Orden polaridad: hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas < aminas < alcoholes < agua
  • Habitualmente la polaridad de la fase estacionaria es distinta de la de los analitos y para la elución se emplea una fase móvil con una polaridad considerablemente distinta.
  • Podemos mejorar la separación manipulando el factor de retención (k), variando la composición de la fase móvil, de manera que su valor se encuentre en el intervalo comprendido entre 2 y 10.
  • También podemos recurrir si es necesario a variar el factor de selectividad (α), cambiando la naturaleza química de la fase móvil, pero manteniendo el factor de retención en los valores apropiados.
  • Es útil el concepto de índice de polaridad (P’), que es una medida numérica de la polaridad de un disolvente (oscila entre –2, para los fluoroalcanos, que son muy poco polares, hasta 10’2, para el agua, muy polar). El índice de polaridad de una mezcla de disolventes A y B se calcula:

cromatografia-reparto-indice-polaridad

En general, se comprueba que un cambio de dos unidades de P’ origina aproximadamente una variación de 10 veces en la constante de reparto k:

cromatografia-reparto-indice-polaridad-constante-k

Comprueba la utilidad de estas expresiones en el ejercicio 3.

Aplicaciones de la cromatografía de reparto

Son muchos los campos de aplicación que presenta la cromatografía de reparto para la separación de diferentes analitos, especialmente mediante cromatografía de fase inversa con fases unidas químicamente:

  • Farmacología: antibióticos, sedantes, esteroides, analgésicos…
  • Bioquímica: aminoácidos, proteínas, glúcidos, lípidos, metabolitos…
  • Alimentación: edulcorantes, antioxidantes, aditivos, aflatoxinas…
  • Industria química: aromáticos, condensados, tensioactivos, propulsores, colorantes…
  • Contaminantes: pesticidas, herbicidas, fenoles, PCB…
  • Medicina clínica y forense: venenos, drogas, alcohol en sangre, extractos de orina, estrógenos…

En algunos casos, es conveniente transformar los componentes de la muestra en un compuesto derivado, de manera que se reduzca su polaridad, se aumente la sensibilidad o la selectividad de la respuesta del detector.