Detectores empleados en HPLC

Los detectores empleados en HPLC se han diseñado, adaptado y perfeccionado con el fin de incorporar celdas de flujo que permitan medir las bajas concentraciones de analito que hay en el líquido. Los distintos detectores se clasifican según se encarguen de medir una propiedad del soluto o de la disolución.

Detector de absorción UV-visible

El flujo de líquido que sale de la columna pasa a través de una pequeña celda, de pequeño volumen (entre 1 a 10 μL), para minimizar el ensanchamiento de banda. La medida de la absorbancia del líquido que la atraviesa en función del tiempo constituye el cromatograma. Su límite de detección oscila entre 0’1 y 1 ng y puede emplearse en cromatografía de elución en gradiente.

detector-absorbancia-UV-HPLC

  • Fotómetro de filtro: es el detector de absorción UV más sencillo. Emplea una lámpara de mercurio como fuente y una serie de filtros para aislar la intensa línea a 254 nm, con la que se mide la absorbancia (variando los filtros se pueden seleccionar otras líneas).
  • Espectrómetro de barrido: permite realizar el análisis seleccionando una o varias longitudes de onda en la región de interés.
  • Espectrómetro de arreglos de diodos: debido a su rapidez, son capaces de registrar la totalidad del espectro proporcionando un cromatograma tridimensional que muestra la absorbancia en función de la longitud de onda cada pequeños intervalos de tiempo.

Cromatograma-3D-a

DETECTOR de absorción infrarroja

Las celdas empleadas en estos detectores son similares a las empleadas en los detectores de absorción UV-vis, excepto por las ventanas ópticas, que en este caso son de cloruro de sodio o de fluoruro de calcio.

Se emplea en aquellos analitos que absorben radiación infrarroja (IR, cuya longitud de onda supera los 700 nm), por lo que se debe prestar atención al disolvente utilizado, ya que muchos de ellos también absorben estas radiaciones.

Los detectores más sofisticados se basan en instrumentos de transformada de Fourier (FTIR). El límite de detección es de 1.000 ng y también pueden emplearse en cromatografía de elución en gradiente.

DETECTOR DE Fluorescencia

Se basan en la capacidad de algunos solutos capaces de emitir fluorescencia, o de aquellos que no lo son pero pueden hacerlo tras un tratamiento adecuado (derivatización).

Los más sencillos emplean una fuente de excitación de mercurio y uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente. Los instrumentos más sofisticados consisten en una fuente de radiación de xenón y emplean un monocromador de red para aislar la radiación fluorescente.

Son muy sensibles, siendo su límite de detección de 0’001-0’01 ng y también se pueden utilizar en elución con gradiente.

DETECTOR DE índice de refracción

En este caso miden una propiedad de la disolución, como es la variación en su índice de refracción como consecuencia de la presencia de un soluto.

Este tipo de detectores constan de una cubeta con dos compartimentos separados por una placa de vidrio, por uno de los cuales solamente pasa fase móvil, como referencia, y por el otro pasa el eluato que abandona la columna y que contiene la muestra. Sobre la cubeta se irradia un haz de luz que se desvía cuando la muestra aparece en el líquido eluido de la columna.

Son detectores universales y no dependen del caudal de fase móvil. Sin embargo, no pueden emplearse en elución con gradiente, sus medidas se ven afectadas por los cambios de temperatura y no son tan sensibles. Su límite de detección se sitúa entre 100 y 1.000 ng.

DETECTOR DE Dispersión de luz

La dispersión se produce por la interacción de la radiación electromagnética con la materia. El eluato que abandona la columna se nebuliza mediante un flujo de nitrógeno o de aire y se vaporiza la fase móvil, quedando únicamente unas finas gotitas de soluto sin evaporar. La nube de partículas de analito pasa a través de un haz de láser y la dispersión producida es detectada por un fotodiodo de silicio.

Este detector responde a todos los solutos menos volátiles que la fase móvil y su límite de detección se encuentra entre 0’1 y 1 ng.

detector-dispersion-luz

DETECTOR electroquímico

Este tipo de detectores responden a analitos susceptibles de reducirse u oxidarse, como fenoles, aminas aromáticas, peróxidos, cetonas, aldehídos, compuestos halogenados, nitroderivados…

Un ejemplo de detector electroquímico es el detector amperométrico, basado en la oxidación o reducción del eluato en un electrodo de trabajo:

detector-amperometrico

En este electrodo se mantiene el potencial a un valor seleccionado, respecto a un electrodo de referencia (Ag/AgCl) y se mide la corriente que pasa entre el electrodo de trabajo y un electrodo auxiliar, de acero inoxidable, en función del tiempo. Para solutos oxidables, son comunes los electrodos de cobre o de carbón vitrificado. Para solutos reducibles, un buen electrodo de trabajo es el de gotas de mercurio.

La corriente es proporcional a la concentración del soluto en un intervalo de seis órdenes de magnitud. Con este detector se debe trabajar en rigurosa ausencia de oxígeno y con disoluciones acuosas, o de disolventes polares, que contengan electrolitos. Presentan una gran sensibilidad, con un límite de detección entre 0’01 y 1 ng. Sin embargo, no pueden ser empleados en elución con gradiente, y dependen de la temperatura y del caudal.

DETECTOR DE conductividad

Estos detectores se basan en los cambios de conductividad de la fase móvil en presencia de moléculas de analito. Están formados por una celda asilada que contiene dos electrodos sobre los que se aplica una diferencia de potencial, de manera que se mide la resistencia que ofrece la mezcla eluida, la cual está relacionada con su concentración.

Este detector es útil para la determinación de analitos iónicos. Su límite de detección se encuentra entre 0’5 y 1 ng. es sensible a los cambios de temperatura y no puede emplearse en elución en gradiente.

DETECTOR acoplado a espectrómetro de masas

El principal problema que surge al acoplar un espectrómetro de masas al cromatógrafo HPLC es la enorme cantidad de disolvente que acompaña al analito, para lo cual se han desarrollado diversas interfases:

  • Termovaporizador (termospray): con esta interfase se vaporiza el eluato y se forma un aerosol, formado por moléculas de disolvente y de analito. Mediante un mecanismo de ionización química, se ioniza el analito y los iones son conducidos hacia el espectrómetro y el disolvente es expulsado mediante una bomba. Los analitos deben ser termoestables y polares.
  • Interfase de ionización química a presión atmosférica (APCI): utiliza calefacción y nitrógeno para convertir el eluato en aerosol, del que se evapora el disolvente. Mediante una descarga eléctrica el analito se convierte en iones que son conducidos hacia el espectrómetro de masas.
  • Interfase de ionización por electronebulización (electrospray): el eluato pasa a través de un capilar metálico, en cuya salida se aplica un fuerte campo eléctrico a la vez que una corriente coaxial de nitrógeno gaseoso, con lo que se crea un fino aerosol de partículas cargadas.

Tipos de detectores en la cromatografía gas-líquido

El detector es el sistema encargado de poner de manifiesto la presencia de soluto o de componentes de la muestra que abandonan la columna. Para ello convierte la medida de una magnitud física, comparándola con la del propio gas portador puro, en una señal amplificada que indicará el momento en el que salen los componentes de la columna.

Describiremos los tipos de detectores más utilizados:

Detector de conductividad térmica (TCD)

Consiste en un dispositivo denominado catatómetro, cuyo funcionamiento se basa en los cambios en la conductividad térmica de gas ocasionados por la presencia de moléculas de analito. Posee un sensor formado por un filamento de Pt o Au calentado eléctricamente, cuya temperatura y, por lo tanto, su resistencia eléctrica, dependen de la conductividad térmica del gas que lo rodea. Los gases portadores más adecuados son el hidrógeno o el helio, pues su conductividad térmica es mayor (los analitos al mezclarse con estos gases disminuyen su conductividad térmica).

detector-conductividad-termica

Características:

  • Respuesta universal
  • Respuesta lineal en un amplio intervalo
  • Fácil de utilizar
  • No destructivo
  • Baja sensibilidad

Detector de captura electrónica (ECD)

Es uno de los detectores más empleados en análisis medioambiental, debido a su selectividad para detectar compuestos que contienen halógenos (como los pesticidas). En él, el gas que abandona la columna atraviesa un emisor de electrones (Ni-63), los cuales provocan su ionización. Al aplicar una diferencia de potencial se crea una corriente eléctrica que constituye la señal. En presencia de compuestos orgánicos la corriente disminuye por su tendencia a captar electrones. Se emplea nitrógeno o argón como gas portador, con un 5 % de metano.

detector-captura-electrones

Características:

  • Detector selectivo (moléculas con grupos electronegativos)
  • Elevada sensibilidad
  • No destructivo (no altera la muestra de manera significativa)
  • Pequeño intervalo de respuesta lineal

Detectores de ionización de llama (FID)

Es el detector más popular en cromatografía de gases. En él la respuesta se produce como resultado de la combustión de los compuestos orgánicos en una pequeña llama de aire-hidrógeno, con desprendimiento de iones (CHO+) y electrones. Si aplicamos una diferencia de potencial entre entre el extremo del quemador y el cátodo colector se genera una corriente eléctrica que, amplificada, constituye la señal analítica. Ésta será proporcional al número de átomos de carbono por unidad de tiempo. La fase móvil que se emplea con este detector es el nitrógeno, ya que es el que proporciona mejor límite de detección.

detector-ionizacion-llama

Características:

  • Sensible a compuestos orgánicos (excepto carbonílicos y carboxílicos)
  • Elevada sensibilidad
  • Respuesta lineal en un gran intervalo
  • Estabilidad y resistencia
  • Fácil manejo
  • Bajo ruido
  • Es destructivo

Detector de ionización termoiónica (TID)

Es un detector selectivo para los compuestos orgánicos que contienen fósforo y nitrógeno, que deriva del anterior. El gas procedente de la columna se quema en presencia de hidrógeno y fluye alrededor de una bola de silicato de rubidio calentada eléctricamente (600-800 ºC), y se forma un plasma de electrones que generan una corriente bajo una diferencia de potencial aplicado (unos 180 V). La intensidad de la corriente será proporcional al número de iones formados, es decir, a la cantidad de analito. No se puede usar nitrógeno como gas portador. Es destructivo y tiene una elevada sensibilidad.

Detector de fotoionización (PID)

En este detector el eluato de la columna se irradia con un haz intenso de radiación ultravioleta, que provoca la ionización de las moléculas. Al aplicar un potencial a través de la celda que contiene los iones producidos se origina una corriente de iones, la cual es amplificada y registrada.

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DETECTOR fotométrico de llama (FPD)

Se trata de un detector que mide la emisión óptica procedente, principalmente, del fósforo y del azufre. Cuando el eluato pasa por una llama mezclado con hidrógeno y aire, de manera análoga al detector FID, los átomos excitados emiten una radiación característica (536 nm y 394 nm) que se puede aislar con un filtro y detectar con un tubo fotomultiplicador.

detector-fotometrico-llama

Características:

  • Es un detector selectivo (P y S; también Pb, Sn, halogenos)
  • Es destructivo
  • Menos sensible al azufre que otros detectores
  • Menor intervalo lineal para el azufre que otros detectores

DETECTOR de emisión atómica (AED)

El gas eluido procedente de la columna se introduce en un plasma de helio obtenido por microondas, que atomiza y excita los elementos de la muestra, obteniéndose sus espectros de emisión atómica característicos. Los espectros son recogidos en un espectrómetro provisto de dos diodos en serie.

detectpr-emision-atomica

DETECTOR Quimioluminiscente de azufre

Permite detectar compuestos que contienen sulfuro (alimentos, bebidas, petróleo). Primero se oxida a SO2, luego en presencia de H2 se transforma en SO, que reacciona con ozono formando SO3 excitado, que emite luz al volver a su estado basal. Permite detectar bajas concentraciones, de hasta picogramos.

detector acoplado a espectrometría de masas

Existen instrumentos híbridos que combinan la cromatografía de gases con otras técnicas, como puede ser un espectrómetro de masas.

En el caso de las columnas capilares el acoplamiento de las dos técnicas puede realizarse de forma directa, pero en las columnas de relleno ha de emplearse un separador de chorro para eliminar la mayor parte del gas portador que acompaña al analito.

Las características más importantes de este método son:

  • Detección universal
  • Elevada sensibilidad
  • Buenos resultados en mezclas orgánicas complejas
  • Elevado coste
  • Complejidad de uso

DETECTOR ACOPLADO A Espectroscopía de infrarrojo

El acoplamiento de cromatógrafos de gases con columnas capilares con espectrómetros de infrarrojo de transformada de Fourier proporciona un potente medio para la separación y la identificación de los componentes de mezclas complejas.

Instrumentación en la cromatografía gas-líquido

La cromatografía de gases (CG) es una técnica que permite trabajar con muestras sólidas, líquidas o gaseosas, siempre que sean volátiles y estables térmicamente.

En un cromatógrafo gas-líquido la mezcla de solutos a separar, una vez volatilizada, se hace pasar a través de una columna, que contiene la fase estacionaria, con ayuda de una fase móvil gaseosa (gas portador). Esquemáticamente:

esquema-cromatografo-gases

Un cromatógrafo de gases consta de los siguientes componentes básicos:

  • Sistema de suministro de gas portador
  • Sistema de inyección de la muestra
  • Columna y fase estacionaria
  • Sistema de detección
  • Sistema de registro y tratamiento de datos

Sistema de suministro de gas portador

A diferencia de otros métodos, la fase móvil en la cromatografía de gases es inerte y no interactúa con la muestra, por lo que su función es la de transportar la muestra y se denomina gas portador.

El gas portador debe cumplir una serie de características:

  • Debe ser químicamente inerte y no interaccionar con las moléculas de analito ni con la columna.
  • Debe obtenerse en un grado de pureza alto (debe estar libre de contaminantes que pueden interaccionar con la muestra, degradar la columna o dar señal en el detector) y a un precio razonable.
  • Debe ser compatible con el sistema de detección empleado.

El gas portador más comúnmente empleado es el helio, pero también se usan el argón, el nitrógeno o el hidrógeno. Se suministran desde un recipiente o bombona a presión, por lo que es necesario incorporar al sistema medidores y reguladores de presión, así como un sistema regulador de flujo y un filtro o tamiz que elimine el agua y otras impurezas.

Aunque la naturaleza del gas portador no sea determinante, la velocidad de flujo de la fase móvil es un factor que afecta a la duración del proceso cromatográfico y a su resolución.

Sistema de inyección de la muestra

Para obtener una alta eficiencia se requiere que la muestra sea de un tamaño adecuado y que la inyección sea rápida, pues en caso contrario se produce una mayor dispersión de las bandas y una menor resolución. La elección del sistema de inyección en CG viene dictada por el tipo de columna empleada (empaquetada o capilar) y por la naturaleza de los solutos a separar.

En columnas empaquetadas el sistema de introducción de la muestra (0’5 a 20 μL) consiste simplemente en la inyección empleando una microjeringa calibrada en un bloque o cabeza de inyección.

En columnas capilares (volúmenes unas 100 veces menores) la inyección es un aspecto crítico y puede realizarse de tres formas:

  • Inyección con división (split injection), cuando los analitos se encuentran en una proporción mayor del 0’1 % en la muestra. La muestra se inyecta a través de un septum y el gas portador arrastra la muestra hacia una cámara donde se la muestra se vaporiza y mezcla. Un sistema divisor permite separar una pequeña fracción conocida de la muestra, que pasa a la columna, y el resto se desecha.

inyeccion-muestra-cormatografia

  • Inyección sin división (splitless injection), apropiada para análisis de trazas de analitos (menos de 0’01 % de la muestra). Se usa el mismo inyector que el empleado para la inyección con división en el que se introduce un volumen elevado de muestra, éste se evapora y se dirige hacia la columna. La columna se encuentra a una temperatura inferior al punto de ebullición del disolvente, de modo que se condensa a la entrada, formando una fina película donde quedan atrapados los componentes de la muestra (preconcentración). Tras ello, la temperatura de la columna aumenta y se inicia la separación.
  • Inyección directa en la columna, sin que exista una cámara de vaporización previa. Se emplea para muestras térmicamente inestables o que presentan analitos cuya volatilidad varía en un amplio rango de temperaturas. En el inicio, la columna se mantiene fría y, tras la inyección, se aumenta la temperatura volatilizando la muestra a la temperatura más baja posible.

Muchas veces es necesario llevar a cabo un proceso de transformación de la muestra en una forma adecuada para poder ser analizada. Una manera de hacerlo es la derivatización, en la que mediante una reacción química se genera un derivado fácilmente detectable. Este método también puede ser aplicado para aumentar la volatilidad de la muestra, mejorar la estabilidad térmica de los analitos o, simplemente, mejorar la resolución cromatográfica.

Columnas y Hornos

Se usan dos tipos de columnas:

  • Columnas empacadas o empaquetadas, menos usadas en la actualidad. Varían desde 1 a 5 metros.
  • Columnas tubulares abiertas o capilares, más eficaces y rápidas. Pueden ser de hasta 100 metros.

Están construidas con sílice fundida, acero inoxidable, vidrio o teflón, con una forma helicoidal de 10 a 30 cm de diámetro, a fin de acomodarlas en el interior del horno.

El horno debe permitir un preciso control de la temperatura, pues de ella dependerá la velocidad del proceso cromatográfico y su resolución. Debe ser ligeramente superior a la temperatura de ebullición promedio de la muestra, de manera que la elución se produzca en un tiempo razonable (cuanto mayor sea la temperatura menor tiempo de retención, pero también, menor resolución). En las mezclas con componentes de temperaturas de ebullición muy distintas suele emplearse un programador de temperatura, que la va aumentando progresivamente.

Por su influencia en el proceso cromatográfico, detallaremos las características de las columnas y las fases estacionarias (pincha sobre los nombres para acceder).

Sistemas de detección

Es el sistema encargado de poner de manifiesto la presencia de soluto o de componentes de la muestra que abandonan la columna. Las características que debe tener un detector ideal son las siguientes:

  • Universal
  • Sensibilidad (de hasta 10–10 o 10–15 g)
  • Estabilidad y reproducibilidad
  • Respuesta lineal para la concentración de analito
  • Amplio rango de temperaturas de trabajo (hasta 400 ºC)
  • Tiempo de respuesta corto e independiente de la velocidad de flujo
  • Fácil manejo
  • No destructivo

Una descripción de los tipos de detectores más utilizados se puede encontrar aquí.