Resolución en las columnas cromatográficas

Una separación cromatográfica se optimiza variando las condiciones experimentales hasta que los componentes de una mezcla se separan completamente en el menor tiempo posible.

selectivity

Para ello se procurará:

  • Modificar las velocidades de migración (o los tiempos de retención) de los solutos: al aumentar la diferencia entre las velocidades (o los tiempos) se mejora la separación.

La resolución (Rs) de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos (A y B), y permite evaluar la separación entre dos bandas con respecto a sus anchos:

resolucion-cromatograma

resolucion-definicion

Con una resolución igual a 1’0 el solapamiento entre los dos picos es del 4 %. Con una resolución de 1’5 el solapamiento es tan sólo del 0’3 % y permite una separación esencialmente completa de los dos componentes:

Resolucion-cromatografia

Factores que aFectan a la resolución de la columna

La resolución de la columna se puede relacionar con los factores de retención de los dos componentes A y B, el factor de selectividad y el número de platos que forman la columna:

resolucion-cromatografica-ecuacion

  • Variación del número de platos (N):

resolucion-numero-platos

Se consigue mejorar la resolución de la columna aumentando el número de platos. Esto se puede conseguir aumentando la longitud (L) de la columna, lo cual aumentaría el tiempo necesario para la separación, o disminuyendo la altura de plato (H). Según la ecuación de van Deemter la altura de plato puede disminuirse con un menor diámetro de las partículas del relleno, un menor diámetro de la columna, controlando la velocidad del flujo o reduciendo la viscosidad de la fase móvil, y empleando tamaños de muestra pequeños para disminuir la resistencia a la transferencia de materia.

  • Variación del factor de retención o capacidad (kB): el valor óptimo debe estar entre 1 y 5. Valores superiores no suponen un aumento significativo de la resolución, pero que dan lugar a tiempos de retención excesivos.

El factor de retención puede adecuarse modificando la temperatura, en el caso de FM gaseosas, o modificando la composición del disolvente, cuando las FM son líquidas.

  • Variación del factor de selectividad (α): el aumento de α (manteniendo kB entre 1 y 5) también puede lograrse modificando la temperatura de la columna o la composición de la fase móvil, o bien, cambiando la naturaleza de la fase estacionaria o mediante algún efecto químico específico.

El problema general de la elución

En muestras complejas de un gran número de componentes, en muchas ocasiones resulta difícil encontrar unas condiciones experimentales únicas que consigan la resolución de todos los picos de los analitos y además permitan la perfecta cuantificación de los mismos.

Una solución frecuente consiste en cambiar las condiciones que afectan a k mientras tiene lugar la separación. En cromatografía de líquidos se recurre a variaciones en la composición de la fase móvil durante la elución (elución en gradiente). En cromatografía de gases, el incremento de temperatura permite conseguir las condiciones óptimas para las separaciones (programación de temperatura).

problema-general-elucion

Parámetros cromatográficos

Cromatograma

El cromatograma es la curva de elución que se obtiene en una cromatografía y representa la señal recogida por el detector en respuesta a la concentración de analito en función del tiempo o del volumen de fase móvil añadido:

cromatograma

  • Tiempo muerto (tM o t0): tiempo requerido para que una especie no retenida alcance el detector.
  • Volumen muerto (VM o V0): volumen de fase móvil necesario para eluir una especie no retenida.
  • Tiempo de retención (tR): tiempo transcurrido desde la inyección de la muestra hasta que uno de los componentes llega al detector.
  • Volumen de retención (VR): volumen necesario para eluir un determinado soluto en la columna.
  • Tiempo neto de retención o tiempo de retención corregido (t’R): es la diferencia entre el tiempo de retención de un componente con respecto al de una sustancia no retenida (ttM).

Los picos cromatográficos tienen forma de curva de error normal o Gaussiana. Estas curvas representan la distribución simétrica de los datos replicados alrededor de la media.

normal GaussFunction

  • Altura de pico (h): intensidad máxima registrada por el detector.
  • Desviación estándar (σ): altura media del pico en el punto de inflexión.
  • Anchura de base del pico (ω): se define como 4σ.
  • Anchura de pico a la semialtura (ω0’5): es igual a 2’354σ.

Constante de distribución

La distribución de un soluto entre la fase móvil y la estacionaria se puede describir mediante el siguiente equilibrio, para un determinado soluto A:

constante-distribucion

Siendo K la constante de distribución entre las dos fases y de ella dependerá, en buena medida, el reparto de soluto entre ellas y, por tanto, su separación. El valor de K se mantiene constante en un amplio intervalo de temperaturas, por lo que existe una proporcionalidad entre las concentraciones de soluto la fase estacionaria y la fase móvil, en cuyo caso se habla de cromatografía lineal y los picos recogidos en el cromatograma son simétricos:

picos-cromatograficos

Las asimetrías suelen ser debidas a la presencia en la fase estacionaria de lugares que retienen al soluto con más fuerza que otros o a la inyección de una cantidad excesiva de muestra.

Velocidad de migraciÓN

La velocidad lineal promedio de la migración del soluto a lo largo de una columna de longitud L se define como:

velocidad-migracion

La velocidad lineal promedio de las moléculas en la fase móvil será:

velocidad-fase-movil

Ambas se pueden relacionar así:

velocidad-migracion-constante-distribucion

Esta última expresión relaciona la velocidad de migración del soluto con la constante de distribución y de los volúmenes de las fases móvil y estacionaria.

Tasa de flujo volumétrico

En el caso de un columna tubular abierta, la tasa de flujo volumétrico F (cm³/min) está relacionada con la velocidad lineal a la salida de la columna:

tasa-flujo-volumetrico

En el caso de una columna rellena, desconocemos el volumen disponible para el líquido, por lo que se expresa así:

tasa-flujo-porosidad

factor de capacidad o de retención

El factor de capacidad o de retención para un soluto A se define como:

factor-retencion

El factor de retención mide la relación entre el tiempo que las moléculas del analito están en la fase estacionaria y el que están en la fase móvil. Se usa para comparar las velocidades de migración de los solutos, y no depende de la forma de la columna o de la tasa de flujo volumétrico.

Lo ideal es que el valor de los factores de retención de los solutos de una muestra oscilen entre 1 y 10. Valores mucho menores que la unidad indican que el analito sale de la columna en un tiempo próximo al tiempo muerto. Valores mucho mayores indican un tiempo de elución excesivamente largo.

FACTOR DE Selectividad

El factor de selectividad de una columna para dos solutos A y B se define como:

Factor-selectividad

La selectividad es una manera de medir la eficiencia de una separación cromatográfica.